Riešenie úlohy > Genomika
V rámci projektu BITCET sa vybudovalo moderné Centrum genomiky na Prírodovedeckej fakulte UK a subcentrum na UVLaF v Košiciach. Nosným programov centra je najmä uskutočňovanie sekvenačných analýz jednak pre členov konzorcia BITCET, ale aj pre vedeckú komunitu na Slovensku. Centrum každoročne vykonáva niekoľko tisíc sekvenačných analýz. O kvalite práce centra svedčí aj postupný nárast sekvenačných výkonov, ktorý sa ustálil až na hranici 30 000 analýz ročne. Zvládnutie takéhoto množstva analýz umožňuje využívanie prístrojov na automatické pipetovanie vzoriek, ale aj ďalších prístrojov a zariadení zaobstaraných v rámci rozvíjania programu genomiky.
Zhrnutie sekvenačných výkonov v rámci BITCETu.
rok |
2005 |
2006 |
2007 |
2008 |
2009 |
2010 |
Počet reakcií |
4639 |
7911 |
6866 |
12619 |
31470 |
30176 |
Postupne prišlo na PriF UK k prispôsobeniu prevádzaných sekvenačných analýz na krátke čítanie avšak vedeckí pracovníci aj naďalej preferujú čítania 1000 bp dlhej kapiláry. Aby sa zvládol narastajúci počet analýz bol zapojený druhý sekvenátor. Postupne počet analýz stúpol aj na tomto prístroji. Celkovo možno konštatovať značné vyťaženie prístrojov aj obslužného personálu (2 osoby).
Zoznam inštitúcií využívajúcich služby sekvenovania
Pracoviská |
|
Contipro CZ |
SZÚ, BA |
BÚ SAV |
ÚBGŽ SAV |
FCHPT STU |
ÚEO SAV |
CHÚ SAV |
ÚMB SAV |
MEDIREX |
Univerzita vet. Lekárstva a farmácie, KE |
PríFUK |
Ústav genetiky a biotech. rastlin SAV, NR |
PÚ SAV KE |
ÚZ SAV |
Geneton s.r.o., BA |
VÚ SAV |
SÚDTARCH, Dolný Smokovec |
VUP |
Súčasťou centra sú aj prístroje slúžiace na Fragmentovú analýzu:
Pracoviská využívajúce ABI 3130xl pre metódu fragmentovej analýzy: KMB PriF UK, LF UK, BÚ SAV, DFNsP BA. Počas riešenia projektu bolo analyzovaných niekoľko tisíc vzoriek. Pri príprave a analýze vzoriek sú využívané nasledovné prístroje: epMotion 5070 (pipetovací stroj), Eppendorf Centrifuge 5804R (centrifúga) a BioRad iCycler (PCR cyklér) pre prípravu vzoriek, ABI 3130xl (genetický analyzátor) pre fragmentovú analýzu. Výsledky analýz sa spracúvavajú a vyhodnocujú pomocou GeneMapper software v3.7. Štandardizovala sa metóda pre vyhľadávanie DNA variácií pomocou flourescenčne značenej SSCP metódy s využitím automatického genetického analyzátora ABI 3130xl.
Prístroje slúžiace na automatickú purifikáciu nukleových kyselín:
Na automatickú purifikáciu sa zakúpili nasledovné zariadenia: epMotion 5070 - automatický pipetovací systém (príprava reakcií), epMotion 5075 VAC - automatický pipetovací systém (príprava reagencíí, izolácia plazmidovej DNA, miešanie a purifikácia sekvenačných reakcií), eppendorf Centrifuge 5804R - centrifúga umožňujúca centrifugáciu 96-jamkových platničiek (purifikácia PCR produktov, príprava sekvenačných reakcií, purifikácia sekvenačných reakcií, finálna úprava vzoriek pred sekvenovaním). Robotický pracovný systém na multifunkčnú manipuláciu s biologickými roztokmi a reagenciami vrátane veľkokapacitnej plne automatizovanej purifikácie nukleových kyselín a proteínov s jednoduchou obsluhou a aplikáciou v duchu "Plug and prep". Otvorený automatizovaný dávkovací systém je vybavený kompletnou integrovanou vákuovou stanicou a prenášacím ramenom. Táto pracovná stanica v kombinácii s vhodnými reagenciami sa využíva ako otvorený systém pre purifikáciu nukleových kyselín či proteínov v 96-jamkových platničkách.
Významným v programe Genomika je laboratórium DIABGENE, ktoré je od roku 2003 spoločným pracoviskom Ústavu exp. endokrinológie SAV v Bratislave a Národného endokrinologického a diabetologického ústavu v Ľubochni. Na pôde ÚEE SAV sa laboratórium venuje DNA diagnostike monogénových foriem diabetes mellitus (najmä diabetu typu MODY, mitochondriálnemu diabetu a neonatálnemu diabetu), DNA diagnostika rôznych podtypov MODY /MODY 1,2,3 a 5/ sa rutinne vykonáva metódou priameho sekvenovania všetkých exónov daného génu, čo je veľmi prácne a finančne náročné. Úspora sa dá dosiahnuť pre-skríningom mutácií systémom dHPLC, ktorý je "zlatým štandardom" pre pre-skríning mutácií monogénových foriem diabetu. Ide o rýchlu metódu, ktorá umožňuje detegovať zmenu v danom úseku DNA a vyselektuje pacientov s mutáciou, ktorí sa následne osekvenujú len na špecifických miestach génu. Preto sa z prostriedkov biotechnologického združenia BITCET zakúpil prístroj dHPLC /Wave 4500, Trans-genomics/ a nainštaloval sa koncom roka 2006.
To umožnilo v roku 2007 zaviesť dHPLC metódy preskríningu pre gény HNF1a (MODY 3) a glukokinázu (MODY 2) a HNF4a (MODY1). Každý z týchto génov obsahuje 10 exónov a promótor, ktoré sa analyzujú pri jednej alebo viacerých teplotách, čím dochádza k spoľahlivému oddeleniu normálnej a zmenenej DNA. Pri zisťovaní vhodnej teploty na analýzu sme v každom exóne testovali v priemere 12 rôznych teplôt. Počas roka 2008 sa ďalej pokračovalo v analýze MODY génov /MODY1,2 a 3/ technikou dHPLC pričom sa stanovilo celkovo 359 vzoriek. Pozitívne vzorky /so zistenou zmenou na dHPLC/ sa následne sekvenovali s cieľom určiť presný typ mutácie/polymorfizmu. V roku 2008 sme sa zamerali na analýzu najmä MODY 1 génu, kde sme vyšetrili 30 rodín s klinickým podozrením na tento podtyp MODY diabetu. U dvoch rodín sme zistili -136 A>G mutáciu lokalizovanú v promótori génu.
V roku 2009 sa technikou dHPLC vykonal preskríning rodín s klinickým podozrením na miernu hyperglykémiu s rodinným výskytom. Skrínovali sme gén pre pankreatickú glukokinázu /GCK/, práve ktorého inaktivačné mutácie sa prejavujú lačnou hyperglykémiou, čo má terapeutické a prognostické dôsledky pre monogénovú cukrovku typu MODY2. Promótorové oblasti génu pre GCK sa však už dlhoročne nesekvenujú pre prakticky nulový výskyt mutácií. My sme však identifikovali novú, doteraz nepopísanú mutáciu -71G>C v nekonzervatívnej oblasti promótora génu pre glukokinázu, a to u 6 nepríbuzných probandov. Vyšetrenia u pokrvných príbuzných odhalili kosegregáciu s lačnou hyper-glykémiou u 39 nosičov mutácie. Haplotypová analýza u 4 slovenských a jednej britskej rodiny ukázala, že mutácia vznikla nezávisle. Mutácia sa nachádza v DNA väzobnom mieste pre transkripčný aktivátor Sp1. Z našich výsledkov jednoznačne vyplýva, že na postavenie diagnózy diabetu typu MODY2 je potrebné sekvenovať aj promótorovú oblasť génu pre GCK. Toto poznanie bolo už aj zapracované do Európskej diagnostickej a liečebnej rukoväte pre diabetes typu MODY.
Prístroj dHPLC je umiestnený v Laboratóriu DIABGENE, ktoré je spoločným pracoviskom Ústavu exp. endokrinológie SAV v Bratislave a NEDÚ v Ľubochni, ktoré vedie prof. MUDr. Iwar Klimeš, DrSc., riaditeľ ÚEE SAV v Bratislave. V roku 2010 sa technikou dHPLC vykonal preskríning mutácií génu pre HNF4A, u pacientov s klinickým podozrením na cukrovku typu MODY1. Pozitívne nálezy boli následne verifikované priamym obojsmerným sekvenovaním. Pre promótorovú mutáciu -136A>G, ktorá kosegregovala s výskytom mutácií v rodine sa vykonali in vitro funkčné analýzy s použitím luciferázového systému. Analýzy potvrdili zníženú funkciu P2 promótora s mutáciou in vitro, čím sa potvrdila diabetogenicita mutácie. V roku 2010 sa tiež zaviedla DNA analýza génov zodpovedných za vznik monogénovej obezity, a to génu pre leptín, leptínový receptor a melanokortínový receptor 4. Analyzovalo sa 40 pacientov s morbídnou obezitou, u ktorých bolo vyslovené klinické podozrenie na monogénový typ obezity.