Proteomika > VÚ SAV > Služby

Centrum

Proteomika

Lokalizácia

Virologický ústav SAV

Názov analýzy/služby

Analýza hmotnostným spektrometrom

Popis analýzy/služby

• priamy nástrek so zberom primárnych hmotnostných (MS) spektier
• priamy nástrek so zberom primárnych hmotnostných (MS) spektier, výber vhodných prekurzorových iónov (max. 3)  a následný zber MS/MS spektier
• separácia zmesi látok nanoAcquity UPLC systémom a následný zber hmotnostných spektier (MS scan)
• separácia zmesi látok nanoAcquity UPLC systémom a následný zber MS a fragmentačných spektier prekurzorových iónov pomocou metódy  DDA(Data Directed Analysis) a ich vyhodnotenie pomocou prehľadávania proteínových databáz

Technické požiadavky na vzorky

Kontaminanty:  Väčšina bežných chemikálii, ktoré sú populárne medzi biochemikmi alebo biológmi sú repelentmi pre hmotnostný spektrometer. Chemikálie na prípravu tlmiacich roztokov, soli a detergenty musia byť preto bezpodmienečne pred MS analýzou odstránené. Najväčším problémom pre proteomiku sú však kontaminácie keratínmi (pozri nižšie). Tie sa nachádzajú všade: šupinky kože, vlasy, chlpy, lupiny, ale aj vzduch či gély. Je preto, priam nemožné sa ich zbaviť úplne, je ale nutné sa aspoň pokúsiť ich obsah minimalizovať.

Modifikácie:V tejto oblasti je menej problémov, ale značnú pozornosť treba venovať výberu detergentov. Musia sa používať vždy len čerstvo pripravené neionové detergenty kvôli obsahu reaktívnych peroxidov. Vyvarujte sa ale najmä kontaktu s aminoskupinu modifikujúcimi alkylačnými činidlami ako sú ketóny, aldehydy, izomočovina a pod. Zabráňte tiež kyslému štiepeniu väzby Asp-Pro, cyklizácii N-terminálneho Gln na kyselinu pyroglutámovú, formylácii  -NH2 skupín a pod.  Je potrebné si tiež uvedomiť, že aj gélová elektroforéza môže indukovať modifikácie proteínov.

Nešpecifická strata: Limitujúcim faktorom uskutočnenia  MS analýz väčšinou nie je kvalita  MS zariadenia, ale skôr úspešná purifikácia proteínov/peptidov vhodných na analýzu. Ani to najcitlivejšie a najsofistikovanejšie zariadenie nedokáže generovať použiteľné dáta zo znečistenej, či kvantitatívne nedostatočnej vzorky. Žiaľ práve proteíny nášho záujmu majú často nízky výskyt. Preto príprava vzorky je najdôležitejším kľúčom k úspechu.
Vyvarujte sa použitia rozpúšťadiel: DMSO, tetrahydrofurán (THF) a dimetylformamid (DMF)!

Zopár rád k minimalizácii nešpecifickej straty:

• Minimalizujte počet krokov pri purifikácii.
• Používajte len silikonizované plasty.
• Udržujte vzorky v malých objemoch, čím minimalizujete kontakt s povrchom.
• Nikdy vzorku nekoncentrujte až do vysušenia.
• Uskladňujte proteínové vzorky a frakcie z HPLC (peptidy vo voda/ACN, 0.1% TFA) pri 4 C  a nie v mrazničke.
  
  

Minimalizácia kontaminácie keratínmi:

• Počas celého experimentu noste bezpúdrové rukavice.
• Používajte vo všetkých krokoch (aj farbenie) vodu min. HPLC kvality.
• Udržiavajte Váš pracovný stôl bez prachu.
• Vždy pred použitím dôkladne vyčistite všetky pomôcky: nádoby na uskladnenie gélu/farbenie, ale aj nástroje na vyrezávanie proteínových škvŕn.
• Uvedomte si, že znečistené nádoby na farbenie sú hlavným zdrojom keratínovej kontaminácie
• Nikdy sa nedotknite gélu holými rukami.
• Noste laboratórny plášť (vlnený sveter = ovčí keratín) a  vlasy zopnuté dozadu. Sliny a zvieracie chlpy na šatách sú ďalším zdrojom keratínu.
• Po umytí odložte a zakryte všetky súčasti zariadenia na gélovú elektroforézu alebo aspoň opláchnite pred použitím.
• Udržiavajte nádoby na gély vždy zatvorené.
• Zabráňte prístupu domácich (psy a mačky) a laboratórnych zvierat do Vášho laboratória
• Pravidelne a čo najčastejšie obmieňajte tlmivé roztoky a rozpúšťadlá
  
  

Spôsob dodania vzorky

Osobne po telefonickej dohode so zodpovedným pracovníkom

Spôsob odovzdania výsledkov

Elektronicky na zadanú mailovú adresu alebo osobne

Použitá prístrojová technika

nanoAcquity UPLC
Q-Tof Premier

Doba vybavenia objednávky

do 10 pracovných dní

Cena analýzy/služby pre člena BITCETu

Nový cenník od 1.2.2007

Cena analýzy/služby pre nečlena BITCETu

Nový cenník od 1.2.2007
(členovia BITCET majú prednosť)

Kontaktná osoba

Ing. Ľudovít Škultéty, PhD.

Doplňujúce informácie

Ak je problém uskutočniť analýzu vzorky, uskutoční sa analýza štandardu s následnou fakturáciou za požadovanú analýzu. V prípade poškodenia nástrekovej nanokapiláry, prípadne kolóny analyzovanou vzorkou, budú účtované oprávnené náklady na ich výmenu.

Objednávkový formulár

Áno

Centrum

Proteomika

Lokalizácia

Virologický ústav SAV

Názov analýzy/služby

Dvojrozmerná elektroforéza

Popis analýzy/služby

• Svojpomocne uskutočnená izoelektrická fokusácia (IEF) na gélových pásikoch s imobilizovaným pH gradientom (IPG).
• Svojpomocne uskutočnená horizontálna elektroforéza v prostredí SDS, alebo v natívnej forme.
• Svojpomocne uskutočnený elektroblot na membránu.
• Svojpomocne uskutočnené skenovanie a analýza vizualizovaného gélu pomocou programu Image Master Platinum

Technické požiadavky na vzorky

Pred identifikáciou individuálneho proteínu v komplexnej zmesi viacerých proteínov tvoriacich bunkový (subcelulárný, organelový, tkanivový...) proteóm je potrebné proteíny (prípadne ich časti) separovať. Bežná, doteraz používaná technológia s veľmi vysokým rozlíšením, na ktorú spoliehajú proteómové analýzy, je dvojrozmerná polyakrylamidová elektroforéza. Procedúra, postupujúca v dvoch krokoch, väčšinou separuje proteíny na základe ich rozdielov najskôr v elektrickom náboji (izoelektrická fokusácia) a následne v molekulovej hmotnosti.

Je nutné si uvedomiť:
2D elektroforéza je vhodná na separáciu aj tisícov až desaťtisícov proteínov.
Zhruba 5% proteínov a 30% peptidov migruje anormálne.
Posttranslačné modifikácie  ovplyvňujú náboj a hmotnosť proteínu (chyba až 50%)
Problematický transport proteínov z gélovej matrice (elektroblot na membránu)

Vzorka na 2D elektroforézu ma obsahovať cca 120-400ug proteínov.

Spôsob dodania vzorky

Osobne po telefonickej dohode so zodpovedným pracovníkom

Spôsob odovzdania výsledkov

Osobne

Použitá prístrojová technika

Multiphor II elektroforetická jednotka so zdrojom stabilizovaného prúdu EPS 3501 XL, UMAX skener, vyhodnocovací program Image Master Platinum (Amersham Biosciences)

Doba vybavenia objednávky

Podľa dohody

Cena analýzy/služby pre člena BITCETu

Nový cenník od 1.2.2007
(Virologický ústav SAV a BITCET poskytuje len pracovný priestor,  prístrojové vybavenie a konzultačnú službu). Spotrebný tovar si hradí objednávateľ z vlastných zdrojov.

Cena analýzy/služby pre nečlena BITCETu

Nový cenník od 1.2.2007
(Virologický ústav SAV a BITCET poskytuje len pracovný priestor,  prístrojové vybavenie a konzultačnú službu). Spotrebný tovar si hradí objednávateľ z vlastných zdrojov.

Kontaktná osoba

Ing. Rudolf Toman, DrSc., Ing. Ľudovít Škultéty, PhD.

Doplňujúce informácie

V prípade fyzického poškodenia zariadenia, alebo jeho častí, budú účtované oprávnené náklady na ich opravu/ výmenu.

Objednávkový formulár

Nie