Genomika > PRIF UK > Služby

Centrum

Genomika

Lokalizácia

Prírodovedecká fakulta UK, Katedra molekulárnej biológie, B-2

Názov analýzy/služby

Sekvenovanie DNA

Popis analýzy/služby

Na našom pracovisku prebieha sekvenovanie na princípe Sangerovej metódy s využitím kitov založených na fluorescenčne značených dideoxy-nukleotidoch s následnou kapilárnou elektroforézou amplifikovaných fluorescenčne značených produktov sekvenačnej reakcie. Konkrétne využívame relatívne univerzálne kity BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit a BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (podrobnejšie informácie na http://www.c-consulting.sk/) a elektroforéza prebieha na prístroji ABI 3130xl Genetic Analyser (podrobnejšie informácie na http://www.c-consulting.sk/). Nami štandardizované protokoly umožňujú pri sekvenovaní kvalitných templátov s kvalitnými primermi dosahovať čítanie sekvencií o dĺžke do 1000 báz.

Technické požiadavky na vzorky

Na uskutočnenie úspešnej sekvenácie vašich DNA je potrebné aby ste dodali templátové DNA (plazmidová DNA, PCR produkty, príp. iné druhy templátových DNA) a primery, ktorými chcete danú templátovú DNA sekvenovať. Na našom pracovisku sú bezplatne k dispozícii najčastejšie využívané sekvenačné primery pre najrozšírenejšie klonovacie systémy syntetizované v kvalite potrebnej pre získanie kvalitného výsledku sekvenačnej reakcie. Zoznam primerov spolu s ich sekvenciami nájdete tu (Primery na sekvenovanie dostupné na KMB PRIF UK). Kvalitatívne a kvantitatívne požiadavky kladené na templátové DNA a vami dodávané primery, ktoré chcete pri sekvenovaní využiť sú nasledovné:

Templátové DNA

• plazmidové DNA - nezávisí na dĺžke inzertu, koncentrácia 100 - 200 ng/ml, rozpustené po purifikácii (napr. kity Stratagene - StrataPrep Plasmid Miniprep Kit, QIAGEN - QIAprep Spin Miniprep Kit) najlepšie v ultračistej vode, množstvo minimálne 10 ml  kvôli zmrazovaniu, rozmrazovaniu a odparovaniu vody s tým spojeným (pri viac ako piatich reakciách s daným templátom treba na každú ďalšiu reakciu pripočítať 2 ml), dodávajte prosím v eppendorfkách, ktoré zohladňujú konečný objem roztoku aby sa minimalizoval objem odparenej časti roztoku (< 100 μl - 500 μl eppendorfky, > 100 μl – 1,5 ml eppendorky);
  
  

• PCR produkty - 200 - 2000 bp dlhé - koncentrácia 10 - 20 ng/ml, opäť rozpustené po purifikácii (napr. kity Stratagene - StrataPrep PCR Purification Kit, QIAGEN - QIAquick PCR Purification Kit, Promega – Promega Wizard - SV Gel and PCR Cleanup Kit) v ultračistej vode, množstvo minimálne 10 ml kvôli zmrazovaniu, rozmrazovaniu a odparovaniu vody s tým spojeným (pri viac ako piatich reakciách s daným templátom treba na každú ďalšiu reakciu pripočítať 2 ml), dodávajte prosím v eppendorfkách, ktoré zohladňujú konečný objem roztoku aby sa minimalizoval objem odparenej časti roztoku (< 100 μl - 500 μl eppendorfky, > 100 μl – 1,5 ml eppendorky).
  
  

Primery

• je lepšie ak sú HPLC prečistené (najmä ak je potrebné robiť viac reakcií s rovnakým primerom), koncentrácia 1 pmol/ml, rozpustené v ultračistej vode, množstvo aspoň 10 ml kvôli zmrazovaniu, rozmrazovaniu a odparovaniu vody s tým spojeným (pri viac ako piatich reakciách s daným primerom treba na každú ďalšiu reakciu pripočítať 2 ml), dodávajte prosím v eppendorfkách, ktoré zohladňujú konečný objem roztoku aby sa minimalizoval objem odparenej časti roztoku (< 100 μl - 500 μl eppendorfky, > 100 μl – 1,5 ml eppendorky).

Spôsob dodania vzorky

Osobne prípadne poštou, s vyplneným informačným listom (Tabuľka na sekvenovanie.doc), tento je možné zaslať aj e-mailom a slúži pre upresnenie, sprehľadnenie a archiváciu informácie týkajúcu sa sekvenovania vašich templátových DNA.

Spôsob odovzdania výsledkov

V elektronickej forme na zadanú e-mailovú adresu

Použitá prístrojová technika

ABI Prism 3130xl Genetic Analyser
Pipetovací automat Eppendorf epMotion 5070, 5075VAC
Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5804 R.

Doba vybavenia objednávky

5 pracovných dní

Cena analýzy/služby pre člena BITCETu

Cena za purifikáciu templátov pred sekvenačnou reakciou, sekvenačnú reakciu, jej precipitáciu (po sekvenačnej reakcii), elektroforézu, základné spracovanie a odoslanie výsledkov formou e-mailu je závislá na požadovanej dĺžke čítania daných templátových DNA:

• purifikácia templátových DNA pred sekvenačnou reakciou – 150,- Sk/ vzorka
• sekvenačná reakcia štandardná s precipitáciou, elfo a základnou analýzou pri dodržaní odporúčaných parametrov templátovej DNA a primerov – 400,- Sk / reakcia
• sekvenačná reakcia individuálna s precipitáciou, elfo a základnou analýzou pri nedodržaní odporúčaných parametrov templátovej DNA a primerov, (napr. vyššia alebo  nižšia koncentrácia spomínaných zložiek reakcie vyžadujúca individuálny prístup k jednotlivým vzorkám enormne predlžujúcim čas prípravy sekvenačných reakcií a deštandardizáciu zavedených protokolov) – 550,- Sk / reakcia
• v prípade väčších počtov štandardných sekvenačných reakcií je možné poskytnúť výrazné zľavy, napr. pri >200 reakcií 380,- Sk / reakcia, >500 reakcií 340,- Sk / reakcia, >1000 reakcií 300,- Sk / reakcia (obdobie, ktoré slúži na stanovenie počtu sekvenačných reakcií pre uplatnenie si nároku na zľavu je kalendárny rok).

Cena analýzy/služby pre nečlena BITCETu

Informácia ddto ako pre členov, ale ceny sú nasledovné

• purifikácia templátových DNA pred sekvenačnou reakciou – 200,- Sk/ vzorka
• sekvenačná reakcia štandardná s precipitáciou, elfo a základnou analýzou pri dodržaní odporúčaných parametrov templátovej DNA a primerov – 500,- Sk / reakcia
• sekvenačná reakcia individuálna s precipitáciou, elfo a základnou analýzou pri nedodržaní odporúčaných parametrov templátovej DNA a primerov, (napr. vyššia alebo  nižšia koncentrácia spomínaných zložiek reakcie vyžadujúca individuálny prístup k jednotlivým vzorkám enormne predlžujúcim čas prípravy sekvenačných reakcií a deštandardizáciu zavedených protokolov) – 650,- Sk / reakcia
• v prípade väčších počtov štandardných sekvenačných reakcií je možné poskytnúť výrazné zľavy, napr. pri >200 reakcií 475,- Sk / reakcia, >500 reakcií 425,- Sk / reakcia, >1000 reakcií 375,- Sk / reakcia (obdobie, ktoré slúži na stanovenie počtu sekvenačných reakcií pre uplatnenie si nároku na zľavu je kalendárny rok).

Kontaktná osoba

Mgr. G. Minárik, PhD.

Doplňujúce informácie

Ak by ste mali problém dosiahnuť dané parametre skontaktujte sa s pracovníkom, ktorý má na starosti sekvenovanie, problém sa prediskutuje individuálne (v princípe je možne spraviť úspešnú sekvenačnú reakciu aj s nižšími koncentráciami templátovej DNA, avšak deštandardizácia protokolu a individuálny prístup k jednotlivým vzorkám bude zohladnený pri sume za takúto seq reakciu). Rovnako ak by vaše templátové DNA nespadali do vyššie uvedených kategórií (plazmidová DNA, PCR produkt), skontaktujte sa s pracovníkom, ktorý má na starosti sekvenovanie.

Vyúčtovanie služieb

Vyúčtovanie prebieha v dvoch termínoch počas kalendárneho roka (apríl a október), príp. keď sa zhromaždí väčší počet vzoriek od dodávateľa je toto možné spraviť individuálne. Pre bližšie informácie sa obráťte na pracovníka, ktorý má na starosti sekvenovanie.

Objednávkový formulár

Áno

Centrum

Genomika

Lokalizácia

Prírodovedecká fakulta UK, Katedra molekulárnej biológie, B-2

Názov analýzy/služby

Fragmentová analýza

Popis analýzy/služby

Aplikácia fragmentovej analýzy na genetickom analyzátore ABI 3130xl umožňuje presné stanovenie veľkosti DNA fragmentov s využitím kapilárovej elektroforézy s následnou laserovou detekciou. Je to spoľahlivá, presná a rýchla metóda vhodná najmä pre vzorky problematicky vyhodnocované štandardnými elektroforetickými separačnými metódami ako je napr. metóda AFLP alebo typizácia STR polymorfizmov. Fluorescenčné značenie a súčasná detekcia až piatich, rôznych farbičiek umožňuje detekciu viacerých, navzájom sa prekrývajúcich fragmentov vhodnú najmä pre multiplex PCR aplikácie. 

Presné stanovenie veľkosti analyzovaných fragmentov je umožnené vďaka DNA veľkostnému štandardu analyzovanému súčasne so vzorkou a následným softwarovým vyhodnotením a stanovením veľkosti fragmentov podľa vypočítanej veľkostnej krivky. V súčasnosti sú na našom pracovisku používané tri veľkostné štandardy GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard, GeneScan™ 500 ROX® Size Standard (www.appliedbiosystems.com) a Internal Lane Standard 600 (www.promega.com) umožňujúce presné stanovenie veľkosti analyzovaných fragmentov v rozmedzí 50 až 500bp resp. 600bp.

Technické požiadavky na vzorky

Keďže laserová detekcia DNA fragmentov na genetickom analyzátore vyžaduje fluorescenčné značenie, je potrebné PCR produkty (jeden z páru primerov) označiť na 5’ konci niektorou z nasledovných fluorescenčných farbičiek:  FAM, VIC, NED, PET, HEX, FL, JOE alebo TMR.

Pri multiplex PCR (resp zmiešavaní PCR produktov) je možné označiť rôzne systémy odlišnými farbami čo umožní detekciu aj pri prípadnom veľkostnom prekrývaní jednotlivých systémov v jednej analýze. Počet a kombinácie rôznych značiek je však vzhľadom k detekčným limitom daným spektrálnym prekryvom emisných spektier značiek limitovaná len na tieto tri kombinácie:

1. 6-FAM, VIC, NED, PET (GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard)
   
2. 6-FAM, HEX, NED (GeneScan™ 500 ROX® Size Standard)
   
3. FL, JOE, TMR (Internal Lane Standard 600)

Ak je želaný počet PCR produktov v jednej reakcii väčší ako počet možných značiek v kombinácii, je možné označiť dva (alebo viac) systémov rovnakou farbou, to však len ak sa očakávané veľkosti týchto produktov neprekrývajú. Súčasná analýza viacerých PCR produktov značených rôznymi farbami je možná aj zmiešaním jednotlivých PCR produktov v pomere  1:1, resp. inom podľa relatívnej kvantity produktov.

Pre analýzu je potrebné minimálne množstvo PCR produktu a vo väčšine prípadov  postačuje 1-2µl. PCR produkty pri prevoze je potrebné chrániť pred svetlom, krátkodobé vystavenie teplote okolia vzorky (farbičky) nedegraduje.

Pri akýchkoľvek otázkach ohľadom značenia, dizajnu, možnostiach analýzy a vyhodnotenia kontaktujte prosím našich pracovníkov.

Spôsob dodania vzorky

Osobne, prípadne poštou. Vyplnený sprievodný list (Fragmentová analýza.xls), ktorý okrem poskytnutia potrebných informácií o označení a použitom fluorescenčnom značení vašich vzoriek slúži aj pre sprehľadnenie a archiváciu informácií týkajúcich sa analýzy vašich vzoriek, zašlite e-mailom.

Spôsob odovzdania výsledkov

Vyhodnotenie analýzy je uskutočnené pomocou Genemapper software v3.7 (www.appliedbiosystems.com). Výsledky sú odovzdávané v elektronickej forme na zadanú e-mailovú adresu vo forme tabuľky kompatibilnej s Microsoft Excel formátom obsahujúcej informácie o detegovaných fragmentoch (veľkosť v bp a intenzita uvádzaná vo výške a ploche signálov) s priloženým obrázkom elektroforetogramu pre dokumentáciu.

Použitá prístrojová technika

ABI Prism 3130xl Genetic Analyser
Pipetovací automat Eppendorf epMotion 5070, 5075VAC

Doba vybavenia objednávky

5 pracovných dní

Cena analýzy/služby pre člena BITCETu

Cena za analýzu a základné softwarové spracovanie výsledkov je 150Sk za vzorku.
Pri väčšom počte analyzovaných vzoriek je možné poskytnúť výrazné zľavy a to na: 135 Sk pri celkovom počte nad 200 vzoriek, 120Sk nad 500 vzoriek a 100 Sk nad 1000 vzoriek ročne.  

Cena analýzy/služby pre nečlena BITCETu

Cena za analýzu a základné softwarové spracovanie výsledkov pre nečlenov BITCETu je 200Sk za vzorku s možnou zľavou na 180, 160, a 140Sk pri celkom počte analyzovaných vzoriek prevyšujúcich počet 200, 500, resp. 1000 ročne.

Kontaktná osoba

Mgr. Andrej Ficek

Doplňujúce informácie

Vyúčtovanie služieb

Vyúčtovanie prebieha v dvoch termínoch počas kalendárneho roka (apríl a október), pri väčšom počte vzoriek  a/alebo individuálnej žiadosti aj v inom termíne. Pre ďalšie informácie sa obráťte na pracovníka zodpovedného za fragmentovú analýzu.

Objednávkový formulár

Áno

Centrum

Genomika

Lokalizácia

Prírodovedecá fakulta UK, Katedra molekulárnej biológie, B-I

Názov analýzy/služby

Real-Time PCR

Popis analýzy/služby

Real-Time PCR založená na meraní rastu fluorescencie v priebehu každého cyklu. Je určená na meranie koncentrácie špecifických úsekov DNA/RNA.

Technické požiadavky na vzorky

Prístroj ABI Prism 7900 HT je možné využívať viacerými spôsobmi:

1. meranie vzoriek pripravených na pracovisku zadávateľa 
2. meranie vzoriek napipetovaných automatom  Eppendorf epMotion 5070 na Katedre molekulárnej biológie
   

Na meranie je možné použiť veľké množstvo fluorescenčných farbív, a využívať  farbivá viažuce sa na dvojvláknovú DNA (SybrGreen) ako aj rôzne spôsoby detekcie založené na hybridizácii (TaqMan próby)

Spôsob dodania vzorky

Osobne po telefonickej dohode so zodpovedným pracovníkom

Spôsob odovzdania výsledkov

Elektronicky na zadanú mailovú adresu

Použitá prístrojová technika

ABI Prism 7900 HT
Pipetovací automat Eppendorf epMotion 5070
Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5804 R.

Doba vybavenia objednávky

3 pracovné dni

Cena analýzy/služby pre člena BITCETu

Dohodou, podľa typu poskytnutých služieb a množstiev experimentov.

Cena analýzy/služby pre nečlena BITCETu

Dohodou, podľa typu poskytnutých služieb a množstiev experimentov.

Kontaktná osoba

RNDr. Hana Drahovská, PhD.

Doplňujúce informácie

Objednávkový formulár

Nie